Um método quantitativo para o isolamento e determinação da morfina no ópio e nas preparações medicinais Um ensaio de morfina em ópio e preparações medicinais em bruto é descrito, com base na purificação cromatográfica do alcalóide, que posteriormente é determinado volumetricamente. Apesar dos muitos métodos publicados sobre a estimativa da morfina no ópio bruto, não existe atualmente nenhum método satisfatório disponível que permita a determinação quantitativa do alcalóide com facilidade e precisão confiável. Os métodos de ensaio da morfina no ópio administrados na maioria das farmacopeias são baseados no tratamento com lima 1 2 da amostra com formação de sal de cálcio, sua subsequente separação de alcalóides acompanhantes e outras substâncias interferentes e, finalmente, a determinação volumétrica da morfina isolada. Outros métodos que utilizam o polarograma 2. Colorimétrico 3. E procedimentos de permuta iónica 4, também foram descritos. Ultimamente, métodos que defendem a adsorção de alcalóides de ópio em alumina 5. E florisil 6 colunas foram publicadas. Os métodos oficiais de farmacopeia têm a desvantagem de ser complicado e exigem muitas manipulações demoradas e tediosas, o que implica perda de precisão. (Este último fato é contrariado na Farmacopeia britânica pela adição de um fator de dez por cento do teor de morfina ao resultado obtido). O principal problema no ensaio da morfina no ópio reside na dificuldade com a qual pode ser separada Dos outros alcalóides que ocorrem naturalmente no ópio, devido às suas propriedades físicas e químicas semelhantes. No entanto, existem algumas diferenças em suas solubilidades em solventes orgânicos. Os dados sobre as diferentes solubilidades de alcalóides de ópio em vários solventes orgânicos foram publicados por Klyachkina 7. Instituto Governamental de Normalização e Controle de Produtos Farmacêuticos, Ministério da Saúde, Govt. Laboratórios Centrais, Jerusalém-Israel. As figuras entre parênteses referem-se a figuras na Bibliografia nesta seção. A partir deste trabalho, sabemos que a morfina é praticamente insolúvel em solventes orgânicos como benzeno, éter, etc., enquanto que os outros alcalóides de opio são bastante solúveis nesses solventes. Por conseguinte, tentamos utilizar estas diferenças, em condições bem definidas e controladas, isto é, empregando a cromatografia, quando se esperava que o isolamento da morfina pudesse ser alcançado. Nossa tarefa consistiu, portanto, em encontrar uma solução simples e prática para cada um dos seguintes problemas: Extração completa de morfina a partir de ópio em bruto. Escolha de um adsorvente adequado para os alcalóides extraídos. Remoção de alcalóides que acompanham a morfina e substâncias interferentes. Escolha do agente de eluição adequado para recuperação quantitativa da morfina purificada. No seguinte relatório é descrito um método curto e simples em que as substâncias interferentes que acompanham são removidas por meio da utilização de uma coluna de adsorção e o alcalóide purificado no eluato é determinado volumetricamente. O primeiro passo na determinação da morfina consiste na sua extração completa do ópio em bruto. Após diferentes procedimentos, como a extração com ácidos e álcalis em diferentes concentrações e em várias temperaturas, e a extração com água destilada, a várias temperaturas, foram testadas, a técnica descrita abaixo foi aceita como a mais adequada. A extração com ácidos revelou-se insatisfatória, devido à liberação simultânea de material de cor escura a partir do ópio em bruto. As substâncias coloridas não podem ser separadas do alcalóide no passo cromatográfico subseqüente. A extração alcalina, por outro lado, produziu uma solução contendo o morfinato correspondente, que se mostrou extremamente difícil de eluir da coluna cromatográfica no estágio subseqüente. Ambos os procedimentos deveriam ser descartados. A água destilada assegurou a extração completa da morfina presente desde que a extração foi realizada a 60 graus C durante pelo menos duas horas. Um aumento adicional da temperatura ou aumento do tempo de extração apenas adicionado à quantidade de substâncias interferentes também entrando em solução. Por outro lado, a incubação a 37 ° C durante 24 horas nos deu resultados semelhantes à extração a 60 graus C. No entanto, o período de extração de duas horas foi finalmente adotado no ensaio descrito. A exaustividade da extração de morfina total a partir do ópio em bruto pelo procedimento descrito acima foi verificada por meio do B. P. E U. S.P. Métodos para a determinação da morfina no ópio. Uma série de substâncias como permutatita, ácido silícico, alumina, celite, misturas de celite com alumina e celite com magnésia foram testadas quanto à sua capacidade de adsorção dos diferentes alcalóides e impurezas do ópio. Estes adsorventes foram colocados numa coluna cromatográfica consistindo de um tubo de vidro de 280 mm. Em altura e com um diâmetro interno de 22mm. Constrangido na extremidade inferior para caber em uma rolha de borracha aberta. Várias quantidades de adsorventes que dão colunas de 2cm. A 10cm. Em altura foram embalados para diferentes graus de aperto por aplicação adequada de uma bomba de vácuo. Várias quantidades do extracto aquoso variando de 2 a 10 ml. Foram utilizados nestas experiências preliminares, que deram os seguintes resultados: Permutite adsorvido nem alcalóides de ópio, nem impurezas. Ácido silícico adsorvido morfina, mas não permitiu a sua recuperação sem remoção simultânea de impurezas. Quando se utilizou alumina, verificou-se que alguns agentes eluentes, tais como éter ou benzeno, removiam a morfina, nem outros alcalóides, enquanto solventes como o clorofórmio removiam tanto a morfina quanto os alcalóides que os acompanham. Celite foi a substância mais eficiente e conveniente para usar. As misturas de celite e alumina ou magnésia não melhoraram a eficácia da coluna, sendo que a alumina causou soluções coloidais indesejáveis com o agente eluente. A celite foi, portanto, adotada como o adsorvente mais adequado, sendo que seis gramas foram utilizados no tubo cromatográfico acima descrito, embalados firmemente a uma coluna de cerca de 80 mm. em altura. Sob estas condições, cinco ml. Do extrato aquoso foram otimizados. Para verificar o pH ideal para a melhor separação da morfina dos outros alcalóides de opio e substâncias interferentes que acompanham, uma série de experiências foram realizadas em colunas ajustadas a diferentes valores de pH, adicionando um dos seguintes reagentes em várias concentrações ao extrato aquoso antes Derramando-o sobre celite: ácido clorídrico, ácido acético e mono-potássio-dihidrogenofosfato. As colunas acidicas foram rejeitadas, como a partição dos solutos a partir do meio aquoso com um pH inferior a 7, revelou resultados insatisfatórios. As colunas com um pH superior a 7 foram consideradas muito mais adequadas para o nosso propósito. A adição de 0.3-0.5ml. De amônia concentrada para cinco ml. Do extracto de ópio antes da aplicação à coluna provou que permitia a desejada separação dos alcalóides sem dificuldade. Igualmente, ao tornar a fase aquosa alcalina com uma solução fraca de hidróxido de sódio, obteve-se uma boa separação dos solutos, mas o uso de amoníaco foi melhorado porque qualquer vestígio desta base que passa pela coluna para o eluato poderia ser facilmente removido Antes da titulação por simples aquecimento. Assim, os resultados das análises assim obtidas foram mais reprodutíveis. Para o transporte seletivo dos solutos da fase aquosa foram testados os seguintes solventes orgânicos e misturas: benzeno, éter etílico, etanol, acetona, clorofórmio, iso-butanol, metanol, CCl4. Éterobutanol 4: 1, clorofórmio-isobutanol 4: 1, fenol 1 por cento em clorofórmio, clorofórmio-metanol 3: 1 e clorofórmio-etanol 3: 1 em volume. Destes benzeno foi encontrado mais adequado nas condições acima para a remoção de alcalóides diferentes da morfina e clorofórmio-etanol para a eluição da própria morfina, deixando a matéria corante, etc. adsorvidos na coluna de celite. Cerca de 100ml. Da mistura de clorofórmio-etanol foi suficiente para a eluição completa da morfina da coluna de Celite adotada, preparada como descrito no procedimento experimental. (Ver figura 1.) A partir do eluído obtido, contendo a morfina, o clorofórmio-etanol foi removido por destilação num banho de água a ferver. Para garantir a remoção completa de possíveis vestígios de amônia, sem, no entanto, expor o resíduo a qualquer alteração oxidativa por aquecimento excessivo, adotamos o procedimento descrito abaixo. Secagem do resíduo a 100oC. Em um forno ou sob pressão reduzida a temperaturas mais baixas não deu melhores resultados do que simplesmente ferver no banho de água. Incidentemente, este último procedimento também causou que os vestígios de matéria corante restante com os cristais de morfina no resíduo se tornassem juntos, de modo que não interferissem na titulação subsequente da morfina isolada. Celite No. 545 ou 655 (Johns-Manville, terra de diatomáceas) Etanol absoluto, U. S.P. Solução de amônia, U. S.P. Hidróxido de sódio A. R. Utiliza-se uma solução de N100 preparada adequadamente diluindo uma solução padrão N10. Sulfato de sódio, anidro. Ácido sulfúrico, conc. A. R. Cloroformo-etanol abs. mistura. Misture 3 partes de clorofórmio com 1 parte de etanol absoluto. Solução Indicadora Shiro-Tashiro. Misture 2 partes de solução a 0,1 por cento de vermelho de metilo em etanol a 96 por cento com 5 partes de solução a 0,1 por cento de azul de metileno em etanol a 96 por cento. A. Extração da morfina. Cinco gramas de ópio finamente pulverizado são triturados em uma argamassa de porcelana com ca. 10 cc. De água destilada por 15 minutos. A suspensão resultante é então transferida para um 250cc tarado. Frasco Erlenmayer com a ajuda de uma garrafa de pulverização contendo água destilada quente, até o aumento total de peso é de 50 gramas. O frasco é tapado e agitado vigorosamente por trinta minutos. O balão é então imerso em banho-maria a 60 graus C durante duas horas. O extracto resultante é centrifugado a 2000 r. p.m. Por dez minutos e a solução sobrenadante finalmente filtrada através de um filtro de papel (Whatman No. 1). O extrato está agora pronto para o próximo passo. B. Separação dos alcalóides em uma coluna cromatográfica Coloque cinco gramas 3 em um tubo de ensaio, adicione 0,3-0,5 ml. De amônia concentrada, cubra com uma almofada de algodão e agite suavemente. Remova a almofada de algodão com uma pincada e despeje o conteúdo do tubo de ensaio na coluna de partição, usando a lã de algodão para transferir todas as partículas de alcalóide precipitado que aderem às paredes do tubo de ensaio. Coloque o algodão na coluna e pressione com uma barra de vidro. Lave o tubo de ensaio duas vezes com cinco ml. Porções de benzeno cada e despeje na coluna. Por conveniência, tome 5ml. E correto para a gravidade específica de 1,02. Coloque a coluna com benzeno e deixe a Celite ficar embebida. Assim que as primeiras gotas de benzeno começam a cair da extremidade inferior do tubo, conecte o frasco de recepção a uma bomba de vácuo, ajustando a taxa de fluxo para aprox. 2 gotas por segundo. Um total de cerca de 150ml. De benzeno é usado para molhar a coluna e lavar os outros alcalóides de ópio. Quando praticamente todo o benzeno passou pela coluna Celite, o vácuo é liberado lentamente (para evitar o deslocamento da coluna Celite pela formação súbita de contrapressão). O frasco de recepção é substituído por um balão de vácuo limpo e 150 ml. De clorofórmio-etanol abs. (3: l) é introduzido na coluna a partir de um funil de separação suspenso do topo da coluna. O vácuo é novamente aplicado para produzir a mesma taxa de fluxo. Observe que o Celite deve sempre ser coberto com solvente. Quando todos menos 1-2ml. Do solvente acima do nível de Celite da coluna passou, o vácuo é cuidadosamente liberado. O eluato é transferido quantitativamente para um 400ml. Frasco Erlenmeyer. C. Destilação do solvente A mistura de clorofórmio-álcool é agora removida por destilação de um banho de água fervente. Ao resíduo no balão cinco ml. De etanol absoluto, indicador neutro para Shiro-Tashiro, são adicionados e novamente destilados. Uma porção adicional de cinco ml. Abs abs. São adicionados e a destilação repetida mais uma vez. O frasco Erlenmeyer é deixado no banho de água fervente por mais 20 minutos para assegurar a remoção completa de vestígios restantes de amônia. D. Determinação volumétrica da morfina Cinquenta ml. De N100 H2SO4 são adicionados ao resíduo no frasco Erlenmeyer, e a solução é aquecida até a ebulição ao longo de uma chama aberta durante cerca de 3 minutos. Após o arrefecimento até à temperatura ambiente por imersão do balão em água gelada, o excesso de ácido está de volta com NaOH N100, utilizando 1 ml. 4 Shiro-Tashiro como indicador. Uma pequena almofada de algodão é embalada na haste estreitada do tubo de divisão 280mm. Em altura e 22mm. No diâmetro interno. Sulfato de sódio anidro. É adicionado até uma camada de cerca de dois centímetros de espessura é formada. Isto é mantido no lugar por algodão-lã embalada por uma vara de vidro. 4 Cerca de 6 grms. De Celite é sugado para uma altura de cerca de 80mm. Com a ajuda de uma haste de vidro para assegurar a uniformidade do adsorvente na coluna. Finalmente, uma pequena almofada de lã de vidro é colocada em cima da camada Celite. Geralmente, 15 gotas eram suficientes, mas em alguns casos era necessário adicionar gotas adicionais do indicador para obter um ponto final afiado. Para determinar a precisão do nosso método proposto, constituímos uma solução de morfina contendo 50 mg. Do cloridrato em 5 ml. Correspondente a 36mg. Da base livre. Os resultados das análises obtidas pelo nosso método foram em média 35,5 mg. Caindo dentro dos limites de 35,5 a 36,5 mg. Em seguida, foram preparadas várias misturas de alcalóides, contendo, além da morfina, alguns dos outros alcalóides de ópio de ocorrência natural em várias proporções. Os resultados da estimativa da morfina em tais misturas e da recuperação de uma quantidade ponderada adicionada a um extracto de opio são apresentados na tabela I abaixo: (A.) RECUPERAÇÃO DE MORFINA DE MISTURAS COM OUTROS ALKALOIDES DE OPIUM Um método simples e preciso para o ensaio De morfina em ópio e preparações medicinais em bruto, que se baseia na sua separação de alcalóides acompanhantes e outros materiais interferentes por meio de cromatografia. Os resultados obtidos por este método revelaram-se reprodutíveis. O método proposto é igualmente aplicável a preparações medicinais, tais como tinturas, extratos e misturas de alcalóides contendo morfina. Onde o etanol está presente nas preparações, ele deve primeiro ser removido por destilação antes da aplicação na coluna. Isso é facilmente conseguido, expulsando o etanol por imersão parcial em um banho de água fervente e depois fazendo o volume original com água destilada. Traços de etanol não interferem. Quanto aos outros alcalóides de ópio que são removidos pelo benzeno: apesar de obtidos em estado purificado, liberados do material corante que acompanha e outras impurezas, não podiam ser determinados volumetricamente, pois nem todos eles são tituláveis estequiometricamente. No entanto, a sua separação e o isolamento de alcalóides individuais podem agora ser possivelmente tentados com resultados promissores. É proposto um ensaio de morfina em ópio e preparações medicinais em bruto, com base na separação cromatográfica do alcalóide, que é então determinado volumetricamente. Um método simples de adsorção cromatográfica foi desenvolvido para separar a morfina de alcalóides acompanhantes e substâncias interferentes presentes no ópio em bruto. O sistema de separação consiste em uma coluna de adsorção de celite, molhada por um extrato aquoso de ópio amoniacal. Os alcalóides que não a morfina lavamos com a ajuda do benzeno, enquanto que uma mistura de álcool etílico CHCl3 foi empregue como agente de eluição para a morfina isolada e purificada. O método proposto é curto, simples e dá resultados reprodutíveis. Os autores desejam expressar seus sinceros agradecimentos ao químico da Secretaria das Nações Unidas pelo interesse amável que ele tomou no decorrer deste trabalho e pelo cuidado no fornecimento do material utilizado. BIBLIOGRAFIA Rosin J. e Williams C. J. Pharm. Abstr. 1, 1053 (1935) ibid 2,215 (1936) Rasmussen H. B. Hahn C. e fígado K. Pharm. Abstr. 12, 20 (1946) (a) Adamson D. C. M. e Handisyde F. P. Analista 70, 305 (1945) Casamada R. S. M. e Toribis A. M. Anales real acad. Fazenda. 14, 433 (1948) De Prado, L. Pharm. Abstr. 1, 309 (1935) Rozenfeld A. D. Chem. Abstr. 27, 1714 (1933) Sanchez J. A. Chem. 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Destes benzeno foi encontrado mais adequado nas condições acima para a remoção de alcalóides diferentes da morfina e clorofórmio-etanol para a eluição da própria morfina, deixando a matéria corante, etc. adsorvidos na coluna de celite. Cerca de 100ml. Da mistura de clorofórmio-etanol foi suficiente para a eluição completa da morfina da coluna de Celite adotada, preparada como descrito no procedimento experimental A. Extração da morfina. Cinco gramas de ópio finamente pulverizado são triturados em uma argamassa de porcelana com ca. 10 cc. De água destilada por 15 minutos. A suspensão resultante é então transferida para um 250cc tarado. Frasco Erlenmayer com a ajuda de uma garrafa de pulverização contendo água destilada quente, até o aumento total de peso é de 50 gramas. O frasco é tapado e agitado vigorosamente por trinta minutos. O balão é então imerso em banho-maria a 60 graus C durante duas horas. O extracto resultante é centrifugado a 2000 r. p.m. Por dez minutos e a solução sobrenadante finalmente filtrada através de um filtro de papel (Whatman No. 1). O extrato está agora pronto para o próximo passo. B. Separação dos alcalóides em uma coluna cromatográfica Coloque cinco gramas3 em um tubo de ensaio, adicione 0,3-0,5 ml. De amônia concentrada, cubra com uma almofada de algodão e agite suavemente. Remova a almofada de algodão com uma pincada e despeje o conteúdo do tubo de ensaio na coluna de partição, usando a lã de algodão para transferir todas as partículas de alcalóide precipitado que aderem às paredes do tubo de ensaio. Coloque o algodão na coluna e pressione com uma barra de vidro. Lave o tubo de ensaio duas vezes com cinco ml. Porções de benzeno cada e despeje na coluna. 3 Por conveniência, tome 5 ml. E correto para a gravidade específica de 1,02. Coloque a coluna com benzeno e deixe a Celite ficar embebida. Assim que as primeiras gotas de benzeno começam a cair da extremidade inferior do tubo, conecte o frasco de recepção a uma bomba de vácuo, ajustando a taxa de fluxo para aprox. 2 gotas por segundo. Um total de cerca de 150ml. De benzeno é usado para molhar a coluna e lavar os outros alcalóides de ópio. Quando praticamente todo o benzeno passou pela coluna Celite, o vácuo é liberado lentamente (para evitar o deslocamento da coluna Celite pela formação súbita de contrapressão). O frasco de recepção é substituído por um balão de vácuo limpo e 150 ml. De clorofórmio-etanol abs. (3: l) é introduzido na coluna a partir de um funil de separação suspenso do topo da coluna. O vácuo é novamente aplicado para produzir a mesma taxa de fluxo. Observe que o Celite deve sempre ser coberto com solvente. Quando todos menos 1-2ml. Do solvente acima do nível de Celite da coluna passou, o vácuo é cuidadosamente liberado. O eluato é transferido quantitativamente para um 400ml. Frasco Erlenmeyer. C. Destilação do solvente A mistura de clorofórmio-álcool é agora removida por destilação de um banho de água fervente. Ao resíduo no balão cinco ml. De etanol absoluto, indicador neutro para Shiro-Tashiro, são adicionados e novamente destilados. Uma porção adicional de cinco ml. Abs abs. São adicionados e a destilação repetida mais uma vez. O frasco Erlenmeyer é deixado no banho de água fervente por mais 20 minutos para assegurar a remoção completa de vestígios restantes de amônia. D. Determinação volumétrica da morfina Cinquenta ml. De N100H2SO4 são adicionados ao resíduo no frasco de Erlenmeyer e a solução é aquecida até a ebulição ao longo de uma chama aberta durante cerca de 3 minutos. Após o arrefecimento até à temperatura ambiente por imersão do balão em água gelada, o excesso de ácido está de volta com NaOH N100, utilizando 1 ml. 4 Shiro-Tashiro como indicador. Uma pequena almofada de algodão é embalada na haste estreitada do tubo de divisão 280mm. Em altura e 22mm. No diâmetro interno. Sulfato de sódio anidro. É adicionado até uma camada de cerca de dois centímetros de espessura é formada. Isto é mantido no lugar por algodão-lã embalada por uma vara de vidro. 4 Cerca de 6 grms. De Celite é sugado para uma altura de cerca de 80mm. Com a ajuda de uma haste de vidro para assegurar a uniformidade do adsorvente na coluna. Finalmente, uma pequena almofada de lã de vidro é colocada em cima da camada Celite
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